Định lượng TSH bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA – hTSH)

NGUYÊN LÝ

Thyrotropin (TSH), một hormone được sản xuất bởi thuỳ trước tuyến yên, là một glycoprotein với trọng lượng phân tử 30.000. Nó gồm hai chuỗi khác nhau về mặt hoá học: chuỗi alpha và chuỗi beta. Chỉ có phân tử hTSH còn nguyên vẹn hoàn toàn là có tác dụng sinh học. Các hormon glycoprotein khác như hLH, hFSH, hCG cũng bao gồm hai chuỗi. Các chuỗi alpha của nhóm hormone này là hầu như giống hệt nhau, trong khi đó các chuỗi beta là đặc hiệu cho hormone và khác nhau về cấu trúc.

RIA-hTSH cho phép định lượng invitro thyrotropin trong huyết thanh hoặc huyết tương người bằng kỹ thuật sandwich 1 bước. Trong quy trình này 1 phức hợp pha rắn kháng thể (KT) kháng TSH (đơn dòng của chuột), TSH trong mẫu và KT kháng TSH được đánh dấu ¹²⁵I (đơn dòng của chuột) được tạo ra. Kết thúc phản ứng, lượng tracer tự do được loại bỏ bằng gạn hoặc hút và sau đó là rửa.

Lượng tracer được gắn một cách đặc hiệu với ống nghiệm được tráng KT được đo bằng máy đo gamma.

Đánh giá các mẫu chưa biết được tiến hành bằng đọc từ đường cong chuẩn được xây dựng dưới các điều kiện giống hệt nhau.

Khi tiến hành các thử nghiệm kép, tối đa là 42 mẫu của người bệnh có thể được đo cùng với một chuẩn.

Các KT đơn dòng được sử dụng trong kit có độ đặc hiệu cao với TSH người.

Khả năng phản ứng chéo với hLH, hFSH và hCG hầu như được loại trừ trong dải nồng độ có liên quan về sinh lý.

Các mẫu ngoài dải đo được pha loãng bằng dung dịch đệm rửa.

Các chuẩn được đo liều dựa vào hTSH 80/558 của Tổ chức y tế thế giới.

Lưu ý: Độ nhậy cực kỳ cao của nghiệm pháp chỉ có thể đạt được nếu các điểm sau đây được tôn trọng:

Tránh ô nhiễm ngoài của ống nghiệm.

Đảm bảo loại bỏ hoàn toàn phần tracer không gắn. Trong khi hút đề phòng tắc các ống dẫn. Sau gạn, thấm khô kỹ ống nghiệm bằng chất hút nước.

Kiểm tra thiết bị đo và bất kỳ phụ kiện nào mà có thể được sử dụng để giữ hằng số zero hiệu lực và nếu cần để khử ô nhiễm.

Phòng ngừa can nhiễu từ các nguồn xạ bên ngoài.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Bác sỹ chuyên ngành Y học hạt nhân

Kỹ thuật viên xét nghiệm RIA

Kỹ sư, kỹ thuật viên vận hành thiết bị đo mẫu

Cán bộ hóa dược phóng xạ

Phương tiện, hoá chất

Phương tiện

2 máy đo bức xạ Gamma (Gamma Counter) đo¹²⁵I và xử trí mẫu tự động theo chương trình của hãng.

2 máy lắc ngang ( 200-350 vòng/phút ,thường dùng 300 vòng/phút ),

2 máy trộn.

Một giá cắm bộ micropipet có số hút 100 μl, 200 μl, 1000 μl và các hộp đựng đầu plastic các loại.

Giá cắm ống nghiệm .

Hoá chất :

RIA kit TSH . Thành phần kit gồm :

01 lọ KT kháng TSH của người gắn ¹²⁵I, hoạt độ< 300 KBq trong 11,5 ml đệm với albumin huyết thanh bò, các KT đơn dòng, sodium azid, màu đỏ.

02 túi x 50 ống nghiệm nhựa tráng KT kháng TSH của người (KT đơn dòng của chuột).

07 lọ chuẩn TSH, mỗi lọ 1 ml ht người, albumin bò, sodium azid (Na₃N) có giải nồng độ từ 0 – 50 μIU TSH/ml (0-77 pmol/l).

01 lọ huyết thanh kiểm tra (CS) TSH chứa 1 ml huyết thanh người, albumin bò và Na₃N có nồng độ TSH cho trước.

03 viên dùng pha dung dịch rửa để trong vỉ ép.

01 túi plastic.

01 hướng dẫn sử dụng.

Các thành phần kit được bảo quản ở 2-8^oC phải đưa về nhiệt độ phòng (18-25°C) trước khi sử dụng. Đệm rửa được chuẩn bị bằng cách hoà tan 3 viên thuốc đệm trong 300 ml nước cất. Tất cả các hoá chất không được sử dụng nên được bảo quản ở 2-8^oC. Các ống nghiệm tráng KT không được sử dụng phải bảo quản trong túi plastic được cung cấp cùng với kit.

CHỈ ĐỊNH

Tất cả người bệnh có bệnh liên quan đến tuyến giáp.

Lồi mắt không rõ nguyên nhân.

Nhịp tim nhanh không rõ nguyên nhân.

Cường giao cảm, tay run…

CHỐNG CHỈ ĐỊNH:

Không có.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

Người bệnh cần nhịn ăn sáng,được lấy 1 ml máu tĩnh mạch không chống đông.

Tiến hành kỹ thuật

Sau khi lấy mẫu máu, huyết thanh được tách bằng phương pháp thông thường. Tiến hành định lượng ngay hoặc bảo quản đến 24h ở 2-8^oC. Thời gian bảo quản lâu hơn nên để ở -20 ^oC, thích hợp hơn là chia đều,tránh làm đông lặp đi lặp lại và tránh làm tan đông. Sau khi làm tan đông, mẫu huyết thanh phải được trộn cẩn thận.

Cảnh báo và đề phòng: Các vật liệu thô có nguồn gốc từ người chứa trong hoá chất của kit này đã được kiểm định với các kit được cấp phép và đã xác định âm tính với KT kháng HIV1, HIV2, HCV và kháng nguyên HbsAg. Tuy nhiên cũng không thể đảm bảo hoàn toàn là những sản phẩm như vậy sẽ không truyền viêm gan, virus HIV hoặc bất kỳ virusẵnào khác, tất cả các vật liệu thô có nguồn gốc người có trong mẫu được định lượng phải được xử trí như tác nhân có tiềm năng nhiễm trùng.

Quy trình định lượng TSH :

Bảng 1: Quy trình định lượng TSH

Các ống nghiệm được đánh số đầy đủ (chuẩn, huyết thanh kiểm tra, huyết thanh mẫu) như bảng 1.

Nhỏ 200 μl chuẩn hoặc mẫu bằng pipet vào đáy ống nghiệm. Nên sử dụng đầu pipet mới cho mỗi mẫu.

Thêm vào mỗi ống nghiệm 100 μl ¹²⁵I anti hTSH.

Các ống nghiệm được lắc trên máy lắc ngang (300 ± 50) vòng/ phút trong 2 h ở 18-25^oC.

Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 ml đệm rửa, hỗn hợp được gạn hoặc hút và rửa lại bằng 1 ml đệm rửa.

Các ống nghiệm được đo trong 1 phút bằng đầu đo gamma.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Số xung/ phút của mỗi chuẩn riêng biệt S_o– S₆ được đánh dấu, dựa vào nồng độ hTSH tương ứng trên đồ thị đã được dựng chiếu theo đó. Đường cong chuẩn phù hợp nhất được xây dựng qua các diểm này.

Các giá trị đo được của huyết thanh kiểm tra và mẫu được đánh dấu trên đồ thị và nồng độ hTSH/ ml được đọc từ đường cong chuẩn.

Các giá trị bình thường:

Dải nồng độ TSH bình thường trong huyết thanh của nam và nữ được xác định là một phần của test lâm sàng RIA-TSH.

Cường giáp <0.25 μIU/ml (n = 1966)

Bình giáp 0.25 – 4 μIU/ml (n = 182), phần lớn <0,1μIU /ml

Nhược giáp ≥5 μIU/ml (n = 50)

Sau kích thích bằng TRH nồng độ TSH ở các đối tượng bình thường tăng từ 230 μIU /ml (n =417). Ở Người bệnh cường giáp, nồng độ TSH dưới 0,5 μIU/ml (n =59), trong khi đó ở Người bệnh nhược giáp các giá trị tăng trên 30 μIU/ml (n= 8).

Ở những ca bệnh nặng kéo dài, nồng độ TSH huyết thanh có thể bị ảnh hưởng và ít nhất là đáp ứng TSH với kích thích TRH bị giảm. Các thuốc có thể kích thích sự tiết TSH (VD các chất đối vận dopamine, hạ calci máu, iođua) hoặc ức chế nó (VD: L-dopa, corticosteroids). Cùng với sự gia tăng của tuổi có sự giảm nhẹ nồng độ TSH và giảm tiết TSH do sự kích thích của TRH.