Định lượng Insulin bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

NGUYÊN LÝ

Định lượng Insulin bằng kỹ thuật IRMAlà kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch phóng xạ không cạnh tranh bánh kẹp (sandwich IRMA)với nguyên lý sau: ủ kháng nguyên có trong mẫu thử với kháng thể đơn dòng kháng insulin bắt giữ đã gắn trên thành ống (bước 1), rửa loại bỏ các thành phần tự do không tham gia vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể đơn dòng đặc hiệu; sau đó cho thêm kháng thể kháng insulin đơn dòng thứ hai có đánh dấu ¹²⁵I, ủ tiếp, rửa lần hai để loại bỏ các kháng thể đánh dấu ¹²⁵I tự do; Cuối cùng đếm hoạt độ phóng xạ trong ống nghiệm với thời gian 1 phút. Nồng độ kháng nguyên có trong mẫu thử tỉ lệ thuận với hoạt độ phóng xạ (cpm).

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Bác sỹ chuyên ngành Y học hạt nhân

Kỹ thuật viên xét nghiệm RIA

Kỹ sư , kỹ thuật viên vận hành thiết bị đo mẫu

Cán bộ hóa dược phóng xạ

Phương tiện, hoá chất

Phương tiện

Máy trộn (vortex type mixer), Máy lắc ngang (shaker) 200 – 350 rpm, thường dùng là 300 rpm, Máy đếm Gamma, Micropipette: 50μl,  100μl, Multipette: 200μl,  300 μl,  2000μl sai số ( ± 1%), Giá gắn ống nghiệm (tubes), Giấy thấm.

Hoá chất

Bộ kit định lượng Insulin gồm:

Kháng thể kháng Insulin đánh dấu ¹²⁵I: lọ 30ml, màu đỏ, hoạt độ phóng xạ: 460 KBq, trực dụng.

Mẫu chuẩn insulin: 06 lọ có thể tích 1mL, màu xanh với nồng độ từ 1 – 5 – 20 – 100 – 250 – 500 μIU/mL và 01 lọ 2 mL chuẩn có nồng độ 0.

01 lọ dung dịch tủa màu cam có thể tích 20 mL, trực dụng.

01 lọ huyết thanh insulin giám sát có dải nồng độ xác định, có thể tích: 1 mL, trực dụng.

01 lọ 25 mL dung dịch đệm dùng để rửa; trước khi sử dụng pha với 975mL nước cất hai lần.

100 ống nghiệm có gắn kháng thể kháng insuline đơn dòng trong thành ống, trực dụng.

CHỈ ĐỊNH

Người bệnh có bệnh lý tiểu đường.

U tụy

CHỐNG CHỈ ĐỊNH:

Không có.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Đưa thuốc thử và mẫu bệnh phẩm ra nhiệt độ phòng (18-25⁰C) tối thiểu 30’ trước khi dùng.

Đánh số kép lên các ống nghiệm (Total, Chuẩn (Standards – St), huyết thanh giám sát (Control serum – CS), bệnh phẩm – P).

Trộn đều thuốc thử, mẫu chuẩn… tránh bọt.

Lấy bệnh phẩm: 0,3 mL huyết thanh.

Tiến hành kỹ thuật:

Cho 50 µl huyết thanh chuẩn (Standard), huyết thanh giám sát (Control cesum), bệnh phẩm vào các ống thử nghiệm tương ứng.

Cho 300 µl kháng thể kháng Insulin đánh dấu ¹²⁵I (Tracer) vào tất cả các ống, kể cả ống T, đậy kín bằng giấy parafilm.

Lắc ngang (250-300 v/phút), ủ 2h ở nhiệt độ phòng.

Rửa 3 lần như sau:

Dốc ống ít nhất 2 phút.

Cho 1 ml dung dịch rửa, dốc ống ít nhất 2 phút (lần 1).

Lặp lại thêm 2 lần như trên.

Đo trên máy đếm Gamma , tính kết quả B_O/T và B/T.

TRỊ SỐ BÌNH THƯỜNG:

Phải làm trị số bình thường của mỗi Labo, trị số trên 68 mẫu serum người bình thường do hãng CIS-Bio cung cấp là:

Plasma: 2 – 17 µIU/mL tức 0,08 – 0,7 ng/mL.

PHA LOÃNG:    

Những mẫu vượt chuẩn cao sẽ được pha với Standard O (hệ số lần lượt 1/2, 1/5, 1/10)

ĐỘ ĐẶC HIỆU

Phản ứng chéo với:

Pork insulin  100%

Bovine insulin 100%

Rat insulin<0,03%

Split 32-33 proinsulin <0,0004%

Split 65- 66 proinsulin 100%

Des 31,32 proinsulin <0,0004%

Des 64,65 proinsulin 100%

C-Peptid <0,003%

Glucagon <0,0001%

ĐỘ NHẠY:

Nồng độ nhỏ nhất khác zero được phát hiện với xác suất 95% là 0, 2 µIU/mL (8 pg/mL).

HOOK EFFECT:

Không có hook effect ở nồng độ <60.000 µIU/mL.

BẢNG TÓM TẮT QUY TRÌNH:

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Sai xót chủ quan & khách quan:

Cho mẫu huyết thanh hoặc kháng nguyên phóng xạ vào các ống nghiệm bị bỏ sót.

Độ chênh lệch số xung phóng xạ giữa hai ống kép chênh lệch nhau > 10% ( CV > 10%) do sai xót khi đưa mẫu hoặc kháng nguyên hay kháng thể gắn phóng xạ vào ống nghiệm.

Sai lệch thể tích của Micropipet; Hoạt độ riêng của chất đánh dấu phóng xạ với kháng nguyên & kháng thể thấp hơn quy chuẩn.

Số xung đo phông của các giếng đếm phóng xạ cao và không ngang bằng nhau.

Khắc phục:

Tập trung khi triển khai làm, sau khi cho mẫu xong cần đưa ống nghiệm cao ngang tầm mắt để quan sát đáy các ống để bổ xung mẫu bỏ sót.

Những mẫu có CV>10% phải tiến hành làm lại; Định kì phải kiểm chuẩn độ chính xác của Micropipet; Triển khai định kỳ nội kiểm và ngoại kiểm với các lab trong nước và trên thề giới; Kiểm tra hoạt độ thuốc phóng xạ với chất gắn và kiểm tra chất lượng thiết bị.

Nồng độ chất cần định lượng quá cao không được ngoại suy mà nên pha loãng huyết thanh mẫu & định lượng lại để khắc phục “hiệu ứng móc”.