Định lượng FT4 bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

NGUYÊN LÝ

Thyroxine có acid amin chứa iod (T₄) do tuyến giáp tiết ra là một hormone mà nồng độ của nó trong huyết thanh được điều hoà bởi cơ chế feedback âm tính liên quan tới TSH. Ở những đối tượng kho  mạnh tuyến giáp sản xuất khoảng 80 μg thyroxine mỗi ngày, trên 99,9% số đó được liên kết với protein huyết tương trong máu. Protein vận chuyển quan trọng nhất là thyroxine-binding globulin (TBG); ở điều kiện bình thường prealbumin (TBPA) và albumin (TBA) ít đóng vai trò quan trọng. Nửa đời sống sinh học của T₄ là ~ 8 ngày.

T₄ được coi là hormon và là tiền chất (hoặc dạng dự trữ) đối với T₃; chất có hoạt độ phân tử gấp 4 lần T₄ nhưng chuyển hoá nhanh hơn T₄ 10 lần. T₃ được tạo ra chủ yếu từ tổ chức ngoại vi từ T₄ bởi monodeiodase nhưng cũng được tiết ít hơn bởi tuyến giáp.

Hiệu ứng sinh học được cho là do lượng hormon tự do T₃ và T₄ không gắn với protein vận chuyển. Khoảng 0,03% lượng T₄ là dưới dạng FT₄. Chức năng chính của chúng là kích thích chuyển hoá. Sự biến đổi so với nồng độ bình thường có thể ảnh hưởng tới tất cả các cơ quan. Ở trẻ em nồng độ thấp bất thường có thể làm giảm phát triển thể chất và tinh thần.

RIA kit FT₄ được sử dụng để xác định nồng độ T₄ tự do bằng phương tiện là các ống nghiệm tráng KT và được tiến hành trong 2 giai đoạn. Trước tiên mẫu huyết thanh được ủ với KT đa dòng pha rắn và sau đó được tách chiết. Ở pha 2, nó được tách và đo sau khi ủ với FT₄ tracer. Cùng với sự cân bằng được tạo ra bởi T₄ với protein liên kết tự nhiên, còn có một cân bằng nữa với KT trong khi ủ với huyết thanh. Hình 1

↔TBG-T₄

Ac-FT₄↔ FT₄↔ Alb-T₄

↔TBPA- T₄

Sự tách chiết sau đó của mẫu huyết thanh trước khi cho thêm tracer đề phòng protein gắn tự nhiên và các biến đổi khác ảnh hưởng đến phản ứng của tracer. Cấu trúc của tracer đã bị biến đổi do vậy so với T₄ nó có tính phản ứng miễn dịch cao hơn với KT. Như vậy một đường cong thích đáng nhất với độ chính xác cao có thể ghi được thậm chí với một nồng độ thấp của KT pha rắn.

Lượng KT thấp khiến FT₄ có thể đo được mà hầu như không biến đổi về cân bằng.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Bác sỹ chuyên ngành Y học hạt nhân

Kỹ thuật viên xét nghiệm RIA

Kỹ sư, kỹ thuật viên vận hành thiết bị đo mẫu

Cán bộ hóa dược phóng xạ

Phương tiện,hoá chất

Phương tiện

Máy đo Gamma Counter đo ¹²⁵I và xử trí mẫu tự động theo chương trình của hãng.

02 máy lắc ngang ( 200-350 vòng/phút ,thường dùng 300 vòng/phút ),

02 máy trộn.

01 giá cắm bộ micropipet có số hút 100 μl và 1000 μl,các hộp đựng đầu plastic các loại.

01 Giá cắm ống nghiệm .

Hoá chất:

RIA kit FT₄ nhập.Thành phần kit gồm :

01 lọ tracer FT₄ – ¹²⁵I, HT < 150 kBq, 105 ml, mầu tím.

02 túi x 50 ống nghiệm tráng KT kháng T₄ (cừu).

07 lọ chuẩn FT₄, mỗi lọ 0,5 ml ht người và sodium azide (Na₃N) với miền nồng độ từ 0 – 90 pg/ml.

01 lọ huyết thanh kiểm tra (CS) FT₄ chứa 0,5 ml huyết thanh người và Na₃N có nồng độ cho trước.

01 lọ đệm, ủ 103 ml màu xanh.

01 túi plastic.

01 hướng dẫn sử dụng.

Định lượng FT₄ được tiến hành dưới điều kiện cân bằng và do vậy phụ thuộc vào nhiệt độ. Vì lý do này mẫu, huyết thanh kiểm tra (HTKT) và chuẩn phải được chuẩn bị ở cùng nhiệt độ. Như vậy, thành phần kit bảo quản ở 2-8^oC phải đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

Tất cả các hoá chất không sử dụng nữa nên bảo quản ở 2-8^oC. Các ống nghiệm tráng KT không sử dụng sau khi mở gói phải được bảo quản trong túi nhựa được cung cấp cùng với kit.

Nếu HTKT bổ sung được sử dụng ngoài huyết thanh của kit thì việc sử dụng, bảo quản các huyết thanh này nên làm giống như mẫu của người bệnh về nồng độ hormon tự do.

CHỈ ĐỊNH

Tất cả những người bệnh có bệnh liên quan đến tuyến giáp.

Lồi mắt không rõ nguyên nhân.

Nhịp tim nhanh không rõ nguyên nhân.

Cường giao cảm,tay run…

CHỐNG CHỈ ĐỊNH:

Không có.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

Người bệnh cần nhịn ăn sáng, được lấy 1 ml máu tĩnh mạch không chống đông.

Tiến hành kỹ thuật

Sau khi lấy mẫu máu, huyết thanh được tách bằng phương pháp thông thường. Tiến hành định lượng ngay hoặc bảo quản đến 24giờ ở 2-8^oC. Thời gian bảo quản lâu hơn nên để ở -20^oC, thích hợp hơn là chia đều, tránh làm đông lặp đi lặp lại và tránh làm tan đông. Sau khi làm tan đông, mẫu huyết thanh phải được trộn cẩn thận.

Quy trình định lượng FT₄ :

Bảng 1: Quy trình định lượng FT₄

Như bảng 1, đánh số đầy đủ các ống nghiệm (chuẩn, HTKT, mẫu). Tất cả các ống nghiệm trong một m  nên được xử trí giống nhau. Mỗi mẻ nên xây dựng một đường cong chuẩn mới.

100 μl chuẩn (hoặc mẫu của người bệnh) được nhỏ vào đáy các ống nghiệm phủ KT. Mỗi mẫu nên sử dụng một đầu pipet mới.

1000 μl đệm ủ được thêm vào mỗi ống nghiệm.

Các ống nghiệm sau đó được lắc trên máy lắc ngang ở nhiệt độ phòng (17-27 ^oC).

Đổ, úp khô trên giấy thấm, các vết dịch dính vào thành ống nghiệm được rửa sạch.

Nhỏ vào mỗi ống 1.000 μl dung dịch FT₄–¹²⁵I.

Như bước 4, ống nghiệm được lắc trong 1 giờ.

Sau đó dung dịch được đổ, úp khô trên bề mặt thấm trong 2-5 phút. Rửa vết dịch dính vào thành ống nếu có.

Hoạt độ phóng xạ trong các ống nghiệm được đo trong 1 phút ở kênh ¹²⁵I của máy đo gamma.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Hoạt độ phóng xạ của tất cả các chuẩn từ S₀– S₆ được đo bằng xung/ phút (cpm), được đánh dấu dựa vào nồng độ FT₄ tương ứng trên đồ thị đã được chuẩn bị. Đường cong lý tưởng thu được bằng sự nối các điểm đó. Nếu chọn cách đánh giá bằng % liên kết B/T thì tổng hoạt độ T nên được xác định và số xung đo được được chia cho giá trị này. Giá trị trung bình của mỗi ca được lấy từ 2 giá trị đo của huyết thanh chuẩn hoặc của người bệnh và nồng độ FT₄ cần đo được đọc từ đường cong chuẩn.

Giá trị đổi: 1 pg/ml = 1.29 pmol/l.

Các giá trị mong đợi

Trong một nghiên cứu ở nhiều trung tâm làm RIA FT₄ trên 858 đối tượng bình giáp, 95% có nồng độ FT₄ là từ 7 – 18 pg/ml = 9 – 23.2 pmol/l.

Cường giáp > 18 pg/ml (> 23.2 pmol/l).

Bình giáp 7 – 18 pg/ml (9 – 23.2 pmol/l).

Nhược giáp <7 pg/ml (< 9 pmol/l).

Tuy nhiên do sự biến đổi theo vùng hoặc labo, người ta khuyên người sử dụng kit xác định các giá trị của riêng labo mình. Đặc biệt, các giá trị giảm ở người già hoặc người bệnh đang nằm viện (nhất là các người bệnh ở các đơn vị hồi sức cấp cứu).