Các xét nghiệm đông máu: Flow cytometry

Flow cytometry hữu ích trong việc chẩn đoán khi chỉ có một lượng nhỏ mẫu máu có sẵn như trong trường hợp trẻ sơ sinh.

Tiểu cầu ở trạng thái chưa hoạt hóa ở trẻ sơ sinh có sự bộc lộ GpIIb/IIIa ít hơn hẳn so với người lớn. Nhưng GpIa/IIa và GpIb thì bình thường.

Flow cytometry có thể dùng để sàng lọc hội chứng Scott bằng cách phân tích Annexin V gắn với màng phospholipid tiểu cầu.

Sự hoạt hóa tiểu cầu có thể được phân tích bởi CD62b (P Selectin) – một thành phần của màng hạt α hoặc CD63 – một phức hợp của protein hạt đặc với màng lysosome. Việc gắn Mepacrine được thực hiện bởi hạt đặc, là maker cho hoạt hóa tiểu cầu.

Các micropaticle tiểu cầu tăng rõ trong hoạt động cầm máu và có thể dùng để phân tích bởi Flow.

Một kỹ thuật ELISA chẩn đoán bệnh Glanzmann’s Thrombasthenia đã được báo cáo [Lobo et al Ann Hematol 2012;91:917-921]. Xét nghiệm này sử dụng kháng thể anti-CD36 để bắt giữ tiểu cầu và sau đó xử lý với proteindisintegrin-alkaline phosphatase đặc hiệu cho GpIIb/IIIa. Kỹ thuật này đơn giản, nhanh và không cần flow cytometer.

Những người bị Glanzmann’s Thrombasthenia sẽ được chia làm 3 type phụ thuộc vào mức biểu hiện GpIIb/IIIa. (Type 1: <5% biểu hiện GpIIb/IIIa; Type 2: 5-20%; Type 3: số lượng bình thường nhưng rối loạn chức năng receptor)

GIỚI THIỆU

Tiểu cầu được gắn nhãn bằng các kháng thể chống lại trực tiếp các glycoprotein màng sau đó phân tích bởi flow cytometry là kỹ thuật nhanh, nhạy cho các LABO đông máu chuyên sâu.

Test có thể thực hiện được với máu toàn phần, PRP, hoặc tiểu cầu rửa. Cần một thể tích mẫu nhỏ, phù hợp với đối tượng sơ sinh.

Flow cytometry được sử dụng trong nhiều bối cảnh:

Theo dõi liệu pháp sử dụng đối vận của GpIIb/IIIa.

Chẩn đoán những khiếm khuyết glycoprotein bề mặt tiểu cầu di truyền

Chẩn đoán bệnh lý kho chứa

Chẩn đoán HIT

Chẩn đoán hội chứng Scott

Và còn nhiều nữa….

Máu toàn phần được sử dụng trong flow giúp vượt qua nhiều vấn đề cố hữu trong phân tích

PRP

Sinh lý hơn

Hoạt hóa tiểu cầu là tối thiểu vì thao tác trên mẫu là tối thiểu

Nhiều receptor tiểu cầu được phân tích một cách tự động

Những kháng thể mới có thể dễ dàng tham gia vào phương pháp đã có

Thể tích mẫu nhỏ

Có thể dùng ở bệnh nhân giảm tiểu cầu đáng kể.

NGUYÊN LÝ

PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

Hình ảnh sau cho thấy vai trò của flow cytometry trong phân tích bệnh Glanzmann’s Thrombasthenia và Bernard Soulier Syndrome. Trong cả 2 trường hợp, chúng ta sử dụng 3 kháng thể CD41, CD61 và CD42b kháng lại trực tiếp các glycoprotein màng

Kháng thể	Độ đặc hiệu
CD41	CD41 nhận ra glycoprotein GpIIb (chuỗi integrin alpha IIb), là thành phần liên kết không cộng hóa trị với GpIIIa (chuỗi integrin beta 3) tạo phức hợp GpIIb/IIIa.
CD61	CD61 nhận ra glycoprotein GpIIIa (chuỗi integrin beta 3) của màng tiểu cầu.
CD42b	CD42b phản ứng với GpIb ở mẫu tiểu cầu và tiểu cầu. CD42b cũng ức chế khả năng gắn của VWF vào tiểu cầu với sự hiện diện của ristocetin cũng như ức chế RIPA.

Tiểu cầu bình thường: Hình 1, mẫu máu bìh thường, tiểu cầu được chọn ra dựa vào FS và SS (Forward và Side Light Scatter) và được khoanh trong vòng màu xanh. Hình 2, tiểu cầu được nhuộm với CD41 (GpIIb) và CD61 (GpIIIa) và cho biểu hiện cả 2 glycoprotein. Hình 3, tiểu cầu được nhuộm với CD42b (GpIb) và CD61 (GpIIa) và biểu hiện cả 2 glycoprotein.

Glanzmann’s Thrombasthenia: Hình ảnh từ bệnh nhân bị Glanzmann’s Thrombasthenia. Hình 5 và 6 cho thấy không có hoạt động của cả CD41 và CD61, cho thấy thiết hụt phức hợp GpIIb/IIIa => bệnh Glanzmann’s Thrombasthenia. Tuy nhiên hình 6 cho thấy hoạt động của CD42b (GpIb) là bình thường

Hội chứng Bernald Soulier

Tiểu cầu bình thường: Hình 1 tiểu cầu được chọn dựa trên SS và gắn CD61. Hình 2 và 3 – tiểu cầu (từ 1 người bình thường) cho thấy hoạt tính của cả CD41 và 61 (Hình 2), hoạt tính của cả CD61 và CD42b (hình 3) chỉ ra rằng receptor GpIIb-IIIa và GpIb là bình thường.

Hình ảnh từ bệnh nhân BSS: Hình 5 cho thấy sự gắn bình thường với CD41 và CD61 chỉ ra phức hợp GpIIb-IIIa bình thường. Hình 6 cho thấy 2 pool tiểu cầu, 1 pool với CD61 và CD42 gắn bình thường (53% tổng tiểu cầu được phân tích) và một pool nhỏ hơn (47%) cho thấy gắn CD61 bình thường nhưng khiếm khuyết với CD42 => vắng GpIb. Đây là trường hợp tiểu cầu của BSS sau khi được truyền tiểu cầu và 2 pool đại diện cho 2 dân số tiểu cầu.

Điều thú vị là (dữ liệu không trình ra) sự phát huỳnh quang trung bình của pool BSS lớn hơn pool tiểu cầu bình thường, phản ánh sự tăng MPV và tiểu cầu lớn ở BSS.

ĐỀ NGHỊ XÉT NGHIỆM NÀO TIẾP?

Nền tảng của test này giúp chẩn đoán hoặc GTT hoặc BSS. Những test thêm vào có thể là giải trình tự gene để xác định đột biến nguyên nhân và nghiên cứu phả hệ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Flow Cytometry

Michelson, A.D., Evaluation of platelet function by flow cytometry. Pathophysiol Haemost Thromb, 2006. 35(1-2): p. 67-82.

Linden, M.D., et al., Application of flow cytometry to platelet disorders. Semin Thromb Hemost, 2004. 30(5): p. 501-11.

Rinder, H.M., Platelet function testing by flow cytometry. Clin Lab Sci, 1998. 11(6): p. 365-72.

Michelson, A.D., Flow cytometry: a clinical test of platelet function. Blood, 1996. 87(12): p. 4925-36.

Percy CL, Macartney N, Pollard B, Rayment R, Collins PW. Laboratory monitoring of Scott Syndrome. Br J Haematol. 2009 Oct 8.

Weiss HJ, Lages B. Family studies in Scott syndrome. Blood. 1997 Jul 1;90(1):475-6.

Zhou Q, Sims PJ, Wiedmer T. Expression of proteins controlling transbilayer movement of plasma membrane phospholipids in the B lymphocytes from a patient with Scott syndrome. Blood. 1998 Sep 1;92(5):1707-12.

Zwaal RF, Comfurius P, Bevers EM. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta. 2004 Mar22;1636(2-3):119-28.